Optimalizované CW lasery pro superrozlišovací mikroskopii živých buněk

29. 08. 2014 | Ing. Pavel Kořán | ProduktyOdborné články

V minulosti bylo rozlišení mikroskopů limitováno hlavně difrakcí světla, která ve viditelné oblasti umožňovala rozlišení v x-y rovině okolo 200 nm a pro konfokální mikroskopii přibližně 500 nm v z-ovém směru. Pro pochopení biologických procesů je však nutné pozorovat velmi jemné struktury, a to s rozlišením až 20 nm, což odpovídá velikosti jedné proteinové molekuly.

Pro takto jemné pozorování byly vyvinuty metody superrozlišovací mikroskopie, které jsou založeny na fluorescenci a různých emisních charakteristikách speciálních barviv. V závislosti na různých mechanismech vybuzení a zhášení fluorescence můžeme superrozlišovací metody rozdělit na dvě skupiny: ty které přímo zvyšují efektivní prostorové rozlišení pomocí deterministického vybuzování (photoswitching) v prostoru a ty, které dosahují vyššího rozlišení díky stochastickému vybuzení jednotlivých molekul v prostoru a čase. Do první skupiny řadíme metody jako jsou STED (stimulated emission depletion), GSD (ground state depletion), SIM (structured illumination microscopy). Mezi stochastické metody pak spadá STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) včetně její přímé modifikace ((d)STORM) a (f)PALM (fotofluorescence photoactivation localization microscopy).

Různé superlozlišovací techniky kladou odlišné nároky na parametry budícího laseru. Techniky na bázi STED vyžadují velmi nízký šum laseru. Další metody potřebují lasery s výkonem pouze pár desetin miliwattu, zatímco jiné lasery s výkonem až několik wattů. V případě konfokálních metod je klíčovým parametrem prostorová módová kvalita svazku a jeho stabilita. Techniky jako SIM, které jsou založeny na interferenci, pak vyžadují stabilní strukturu podélných módů laseru. Společným požadavkem všech fluorescenčních technik je pak správná excitační vlnová délka, která odpovídá absorpčnímu spektru použitého barviva.

Všem těmto požadavkům vyhovují OPSL (Optically Pumped Semiconducot Laser) lasery z řad Coherent OBIS, Coheren OBIS LG, Coherent Genesis a Coherent Sapphire, které poskytují výstupní výkon v řádu od několika desetin miliwattu po několik wattů. Řady OPSL laserů poskytujímodely, které jsou schopny ve viditelné oblasti generovat jakoukoliv vlnovou délku od 458 nm do 594 nm a 355 nm v uv. Je tak možné vybrat specifický laser pro konkrétní barvivo. Lasery jsou také flexibilní co se týče generovaného výkonu, který může hladce přecházet mezi méně než 10% a maximálním výkonem laseru, a to beze změny směru svazku nebo jeho prostorové módové struktury. Další výhodou OPSL laserů je jejich nízký šum a v případě modelů OBIS a Genesis možnost analogové modulace až do 100 kHz.

V aplikacích naleznete konkrétní popis metody STORM s využitím laseru Coherent Genesis.